獸醫診斷制品試驗研究技術指導原則（征求意見稿）
各有關單位：
為進一步加強獸醫診斷制品研究技術指導工作，我中心按照《獸醫診斷制品注冊分類及注冊資料要求》（農業農村部公告第342號），起草了《獸醫診斷制品試驗研究技術指導原則（征求意見稿）》（附件1），現公開征求意見，請各有關單位認真研究，并于2022年5月31日前將書面意見（附件2）發送至shengyao3564＠163.com。
農業農村部獸藥評審中心
2022年5月10日
附件1：獸醫診斷制品試驗研究技術指導原則（征求意見稿）.docx附件2：《獸醫診斷制品試驗研究技術指導原則（征求意見稿）》征求意見表.xlsx
附件1
獸醫診斷制品試驗研究技術指導原則
（征求意見稿）
1 目的 為獸醫診斷制品的研制提供原則性指導。
2 背景 根據《獸藥管理條例》中的有關規定，獸醫診斷制品屬于獸藥。獸醫診斷制品的申報和審批程序，與預防和治療類獸用生物制品相似。但是，獸醫診斷制品的研制內容和申報資料項目要求仍具有其特殊性。
3 獸醫診斷制品的主要技術指標
3.1 敏感性 包括分析敏感性和診斷敏感性。分析敏感性是指制品能夠檢測出樣本中被分析物的最小量，即最低檢出量。診斷敏感性是指制品能夠檢測出已知陽性樣本的陽性率。
3.2 特異性 包括分析特異性和診斷特異性。分析特異性是指制品將檢測的目的因子與其他因子區分開來的能力。診斷特異性是指制品能夠檢出已知陰性樣本的陰性率。對抗體檢測制品，除對已知未感染（未免疫）動物樣本的陰性率外，還應通過檢測與目標疾病病原存在交叉反應的相關病原免疫的動物血清或自然感染血清的交叉反應來確定。對抗原及核酸診斷制品，除對已知未感染（未免疫）動物樣本的陰性率外，還應通過檢測與目標疾病病原存在交叉反應的抗原或基因的交叉反應來確定。
3.3 重復性 一般以變異系數表示。即用診斷制品對已知的陰性、弱陽性、強陽性樣品進行多次測定，計算檢測結果的變異系數，確定方法的可重復性。變異系數必須在可接受的范圍內。
3.4 符合率 是指采用不同方法對相同樣品檢測結果的一致程度。
3.5 適應性 是指在不同環境條件下診斷制品檢測結果的可靠性。
4 試驗設計要點
4.1 在設計試驗時，應根據《獸藥注冊辦法》《獸醫診斷制品注冊分類及注冊資料要求》中的有關要求（如診斷制品的試驗項目、試驗批數、試驗數據）及上述主要技術指標進行試驗設計。
4.2 實驗室試驗
4.2.1 對采用完整病原體制備抗原或血清的產品,應對病原體進行以下鑒定。
4.2.1.1 生物學特性。應明確病原體的來源、血清型或基因型和培養特性。
4.2.1.2 純粹或純凈性 應進行無菌、純粹、支原體、外源病毒等檢驗。一般應采用《中國獸藥典》收載的方法。無標準方法的，可采用自行建立的方法，但須進行方法確認。
4.2.2 對采用人工合成或基因重組表達技術制備的抗原，應提供選擇依據，進行不同序列抗原的比較試驗，提供的試驗數據應能證明所采用的抗原是最佳選擇。還應采用自然感染或人工免疫獲得的抗體進行驗證，必要時，應提供與采用常規方法（如完整病原體提?。┲苽涞目乖谋容^試驗數據，以證明合成或重組表達抗原與診斷目標抗原的同源性。
4.2.3 對采用人工合成或基因重組技術制備的引物或基因片段，應提供選擇依據，進行不同序列引物的比較試驗，提供的試驗數據應能證明所采用的引物序列是最佳選擇；應對引物或基因片段進行序列測定，以證明該序列與診斷目標相關基因序列的同源性。
4.2.4 對于使用人工合成或基因表達抗原制備的抗體，應經自然抗原進行驗證。
4.2.5 生產工藝研究
4.2.5.1 抗原、抗體、核酸、多肽等主要物質的制備和檢驗。對于抗原，應包括培養方法、濃縮純化方法、效價及特異性測定等。對于抗體，應包括制備用動物種類、免疫劑量、免疫途徑、免疫次數、采集時間、抗體純化方法、標記方法、效價和特異性測定等。對于核酸、多肽等，應包括鑒定方法和鑒定標準等。
4.2.5.2 陰、陽性對照品的制備和檢驗。陽性對照品制備和檢驗研究中含量或效價等結果應采用研發試劑盒之外的方法進行確認。
4.2.6 診斷試驗反應條件的研究。包括載體、配套試劑、反應時間等，需通過不同試驗條件下的比較試驗確定最佳的實驗參數。對于免疫學類制品，試驗條件的篩選可結合抗原、抗體的效價及敏感性、特異性測定方法同時進行。對于分子生物學類制品，試驗條件的篩選可結合引物設計、基因擴增及敏感性和特異性測定方法同時進行。
4.2.7 診斷制品檢測臨界值與結果判定標準確定的研究。應根據制品方法原理、產品用途，結果判定方法等采用符合統計學要求的樣本數量進行研究，根據統計學等科學方法確定診斷制品臨界值與結果判定標準。
4.2.8 試劑盒的組裝及成品檢驗 在制備所有試劑盒組分并經半成品檢驗合格后，可進行試劑盒組裝。組裝時，應根據實際應用情況來確定每個試劑盒的試劑用量，采用最方便使用的包裝。
4.2.9 質控樣品的制備、檢驗和標定
如成品檢驗所用質控樣品為非國際或國家標準品（參考品），應制定檢驗標準、確定標定方法，提供檢驗報告和標定報告等。質控樣品標準一般應包括定量或定性指標，測定方法原則上應使用金標準方法或經典方法，不能用本制品的方法。敏感性質控品應邀請不少于2個外部實驗室進行協作標定。質控樣品類型應滿足以下要求。
4.2.9.1 免疫學類診斷制品
4.2.9.1.1 用于檢測抗原類制品。敏感性質控品通常為特定含量的滅活病原。特異性質控品除陰性樣品外，還應包括可能出現交叉反應的其它病原。
4.2.9.1.2 用于檢測抗體類制品。敏感性質控品通常為特定效價的陽性血清。特異性質控品除陰性樣品外，應包括出現交叉/干擾反應的其它血清。還應根據產品組分、工藝過程確定可能與檢測標的物產生非特異性反應的其他樣品，如生產包被抗原時所用細胞、表達載體等的陽性血清等。
4.2.9.2 分子生物學類診斷制品
敏感性質控品通常為一定含量的滅活病原或特定拷貝數的質粒。特異性質控品除陰性樣品外，還應包括可能出現交叉反應的其它病原或核酸。
4.2.10 診斷制品成品檢驗項目和標準的確定
4.2.10.1 性狀檢驗 應確定診斷制品的包裝及內容物的外觀性狀和標準。
4.2.10.2 無菌檢驗 根據試劑盒用途、組分特性等確定，對污染后可能影響結果判定的液體組分，應按《中國獸藥典》進行無菌檢驗。
4.2.10.3 敏感性檢驗 對系列稀釋的敏感性質控品進行檢測確定分析敏感性（最低檢測限）。
4.2.10.4 特異性檢驗 對特異性質控品進行檢測確定分析特異性。
4.2.11 診斷制品質量研究
診斷制品應開展敏感性、特異性、重復性研究，對于創新型診斷制品，還應進行比對研究，其結果應滿足制品作用與用途的要求。
4.2.11.1 敏感性研究
4.2.11.1.1 分析敏感性研究 將一定數量已知抗原含量或抗體效價的樣品進行系列稀釋后，使用至少3批診斷制品進行檢測，確定制品的分析敏感性（最低檢測限）。
4.2.11.1.2 診斷敏感性研究
應使用至少3批診斷制品對已知陽性樣品進行試驗，樣品數量應滿足統計學要求，樣品類型應根據制品特性、作用與用途等設定，一般應包括或滿足以下要求（1）已知感染和免疫動物樣品；（2） 經經典（參考）方法確認的陽性樣品；（3）經經典（參考）方法確認的弱陽性樣品或測定結果接近陰陽性臨界值的陽性樣品；（4） 主要的基因型/血清型樣品；（5） 如制品用于檢測多種動物，應包括每種動物的檢測樣品；（6）制品所適用的每種樣品類型（如全血、血清、血漿、口腔液、糞便等）；（7）有國際或國家標準品（參考品）的，一般應包含這些參考品。
將診斷制品的檢測結果與經典（參考）方法的檢測結果進行比較，樣品的檢測結果如與已知敏感性樣本的感染狀態或與經典（參考）方法的檢測結果相一致，則判為真陽性（TP），如不一致，則判為假陰性（FN）。根據比較結果確定診斷制品的診斷敏感性。
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經典（參考）方法陽性 |
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制品方法陽性 |
真陽性（True Positive，TP） |
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制品方法陰性 |
假陰性（False Negative，FN） |
診斷敏感性（DSe）=TP/(TP+FN)×100%
4.2.11.2 特異性研究
4.2.11.2.1 分析特異性研究 應使用至少3批診斷制品對一定數量的已知陰性樣品進行試驗。
4.2.11.2.2 診斷特異性研究
應使用至少3批診斷制品對經經典（參考）方法確定的無被檢標的物樣品進行試驗。樣品數量應滿足統計學要求，樣品類型應符合以下要求。
（1）免疫學類制品
用于抗體檢測的免疫學制品特異性樣品至少應包含（1）已知陰性樣品；（2）可能存在交叉反應的其他病原或不同血清型病原的陽性血清；（3）制備抗原所使用的細胞和/或表達載體的陽性血清；（4）作用與用途中涉及的樣品類型，如血清、組織液等。
用于抗原檢測的免疫學制品特異性樣品應至少包含（1）已知陰性樣品；（2）可能存在交叉反應的其他病原或不同血清型病原；（3）作用與用途中涉及的樣品類型，如血清、組織液等。
（2）分子生物學類制品
特異性樣品應包括（1）已知陰性樣品；（2）可能存在交叉反應的其它病原體或核酸；（3）可能存在交叉反應的不同血清型、基因型的病原（核酸）或國內主要流行的其它血清型、基因型病原（核酸）；（4）作用與用途中涉及的樣品類型，如血清、拭子和各種組織樣品等。
將診斷制品的檢測結果與經典（參考）方法的檢測結果進行比較，樣品的檢測結果如與已知特異性樣本的感染狀態或與經典（參考）的檢測結果相一致，則判為真陰性（TN），如不一致，則判為假陽性（FP）。根據比較結果確定診斷制品的診斷特異性。
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經典（參考）方法陰性 |
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制品方法陰性 |
真陰性（True Negative，TN） |
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制品方法陽性 |
假陽性（False Positive，FP） |
診斷特異性（DSp）=TN/（TN+FP）×100%
4.2.11.3 重復性研究。應使用至少3批產品及批內不同制品（每批至少5個）對已知陰性、弱陽性、強陽性樣品進行至少4次重復測定，計算批內、批間變異系數，確定該制品的重復性檢驗方法和標準。
4.2.11.4 適應性研究。對創新型獸醫診斷制品，應進行適應性研究。由不少于3家獸醫實驗室（分布于不同省份）對3批診斷制品進行適應性檢測（包括敏感性、特異性），并出具評價報告（含批內、批間差異分析）。
4.2.11.4.1 比對試驗方案制定
應根據制品用途制定比對試驗方案。制定試驗方案時，應確定以下內容：獸醫實驗室、抽樣方式和數量、評價參數等。
比對試驗所需樣品和診斷制品通過符合要求的運輸方式送達各獸醫實驗室。各獸醫實驗室應采用統一的試驗方案和數據統計分析方法及記錄格式，獨立開展比對試驗。各獸醫實驗室將測定結果進行統計分析，根據評價指標形成各自的實驗室結果。研制單位將參與比對實驗室的實驗結果匯總后，進行整理、統計分析，形成評價報告。
4.2.11.4.2 獸醫實驗室的選擇
參與比對試驗的獸醫實驗室應具備相應的技術能力（包括專業技術人員和相應的儀器設備）。
4.2.11.4.3 抽樣方式和數量
為保證結果具有統計學意義，診斷制品的數量必須滿足一定的要求。采取隨機取樣的方法抽取同一批次內診斷制品開展比對試驗來進行批內差異分析。
所用樣品應包括一定數量的陽性、弱陽性、陰性等各類臨床樣品，總樣品數量應不少于30份。樣品按編盲方式進行比對。
4.2.11.4.4 比對試驗評價參數
評價比對試驗應根據診斷制品的用途確定，一般包括分析敏感性、分析特異性、診斷敏感性、診斷特異性。
（1）分析敏感性：同4.2.11.1.1
（2）分析特異性：同4.2.11.2.1
（3）診斷敏感性：同4.2.11.1.2
（4）診斷特異性：同4.2.11.2.2
4.2.11.5 保存期研究 應將至少3批診斷制品在適當條件下保存，并間隔一定時間，按成品質量標準中核心指標進行檢測，并與原始成品檢驗數據進行比較，確定診斷制品的保存條件和有效期。一般情況下，試驗過程應持續到所規定的保存期后1個月。
4.2.11.6 符合率研究 應選擇已知陽性、弱陽性、陰性樣品，進行診斷制品與其他診斷方法比較的試驗研究。
4.3 中試生產 按照實驗室試驗確定的生產工藝在獸醫診斷制品GMP生產車間連續生產至少3批診斷制品，按照確定的成品檢驗標準進行全面檢驗。
根據中試生產情況，可對生產工藝進行適當調整，使其更能適應工業化生產。
對于創新型獸醫診斷制品，中試生產批數至少6批。
4.4 臨床試驗報告
采用一定數量的試劑盒對臨床樣品（包括陽性和陰性樣品）進行檢測，分析診斷制品的實際應用效果。
來源：中國獸醫藥品監察所
